人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒工作原理

实验原理：
人促甲状腺素释放激素(TRH)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人促甲状腺素释放激素(TRH)水平
。用纯化的人促甲状腺素释放激素(TRH)抗体包被微孔板
，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入促甲状腺素释放激素(TRH)，再与HRP标记的促甲状腺素释放激素(TRH)抗体结合
，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物


，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色
。颜色的深浅和样品中的促甲状腺素释放激素(TRH)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)
，通过标准曲线计算样品中人促甲状腺素释放激素(TRH)水平。

操作步骤
1. 标准品的稀释与加样


：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl

，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl

，混匀
；然后从第一孔




、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl
，混匀
；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉





，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五
、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七


、第八孔中


，再在第七

、第八孔中分别加标准品稀释液50μl


，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl
，浓度分别为180U/mL, 120U/mL , 60U/mL, 30U/mL,15 U/mL)


。
2. 加样
：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)
、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl
，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)
。加样将样品加于酶标板孔底部
，尽量不触及孔壁
，轻轻晃动混匀
。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液

：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜

，弃去液体
，甩干

，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干



。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl




，空白孔除外
。
7. 温育：操作同3




。
8. 洗涤：操作同5







。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl

，再加入显色剂B50μl
，轻轻震荡混匀

，37℃避光显色15分钟.
10. 终止


：每孔加终止液50μl



，终止反应(此时蓝色立转黄色)
。
11. 测定

：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行
。